发酵技术与工程

发酵技术与工程

发酵与发酵技术

1857 年，法国微生物学家巴斯德通过实验证明，酒精发酵是由活的酵母菌引起的。此后，人们才开始了解发酵的本质。这里所说的发酵（fermentation），是指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。不同的微生物具有产生不同代谢物的能力，因此利用它们就可以生产出人们所需要的多种产物。

腐乳是我国古代劳动人民通过微生物发酵制作而成的一种大豆食品。早在公元 5 世纪的北魏古籍中，就有关于腐乳生产工艺的记载。千百年来，腐乳一直受到人们的喜爱。这是因为经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分子的肽和氨基酸，味道鲜美，易于消化吸收，而腐乳本身又便于保存。多种微生物参与了豆腐的发酵，如酵母、曲霉和毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。

像这种直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术一般称为传统发酵技术。传统发酵以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主，通常是家庭式或作坊式的。利用传统发酵技术制作的食品还有酱、酱油、醋、泡菜和豆豉等，它们是我国传统饮食文化的重要组成部分。

发酵技术的历史

约 9000 年前，我们的祖先就会利用微生物将谷物、水果等发酵为含酒精的饮料。后来，人们通过自然发酵或曲种传代的固体发酵方法生产其他食品，如酱油、醋、豆豉、腐乳和酸奶等。

1857 年，法国微生物学家巴斯德通过实验证明，酒精发酵是由活的酵母菌引起的，从而将酵母菌与发酵联系起来。

1897 年，科学家发现了酶在酵母菌发酵中的作用，逐渐了解了发酵的本质。之后的 30 多年间，微生物的分离和纯化技术得到了应用，发酵生产的工艺和设备不断完善，传统的固体发酵开始向半固体发酵和液体发酵演变。同时，作坊式的手工生产向近代工业化生产方向发展。利用微生物生产的新产品，如酒精、柠檬酸和淀粉酶等不断出现。

20 世纪 40 年代抗生素工业的兴起，标志着人类对微生物代谢调控能力的质的飞跃。在发酵工程中，我们通常将微生物的代谢产物分为初级代谢产物（如氨基酸、核苷酸等，微生物生长繁殖所必需）和次级代谢产物（如抗生素、毒素、激素等，通常在生长稳定期产生）。青霉素的生产就是一个典型的控制微生物进入稳定期以积累次级代谢产物的过程。

20 世纪 40 年代，利用发酵工程大规模生产青霉素成为研究的主攻方向。由于青霉素产生菌是需氧型的，科学家在厌氧发酵技术的基础上，建立了深层通气液体发酵技术，使青霉素的生产实现了产业化。不久，随着链霉素、金霉素和土霉素等抗生素的发现及生产，抗生素发酵工业兴起。

1957 年，用微生物生产谷氨酸获得成功。20 世纪 60 年代，科学家通过研究微生物的代谢途径，继续改进发酵技术，通过人工诱变特定微生物，获得了具有更高生产能力的突变类型。之后，酶制剂、多糖、维生素发酵工业相继兴起。

20 世纪 70 年代以后，基因工程、细胞工程等的发展，使发酵工程进入了定向育种的新阶段。例如，运用基因工程可以将动植物的基因转移到微生物中，获得具有特殊生产能力的微生物，大量生产人们所需要的产品，如人胰岛素、干扰素等。

20 世纪 80 年代，科学家开始运用数学、动力学、化学工程原理以及计算机技术对发酵过程进行综合研究，以更加合理地控制发酵过程。

发酵技术的原理

传统发酵食品的制作离不开各种各样的微生物。乳酸菌是厌氧细菌，在无氧的情况下能将葡萄糖分解成乳酸（反应简式 1），可用于乳制品的发酵、泡菜的腌制等。乳酸菌种类很多，在自然界中分布广泛，空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内都有乳酸菌分布。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。

制作传统泡菜是利用植物体表面天然的乳酸菌来进行发酵的。发酵期间，乳酸会不断积累，当它的质量分数为 $0.4\% \sim 0.8\%$ 时，泡菜的口味、品质最佳。泡菜在腌制过程中会有亚硝酸盐产生。膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，但如果人体摄入过量，会发生中毒，甚至死亡。

酵母菌是一类单细胞真菌，能以多种糖类作为营养物质和能量的来源，因此在一些含糖量较高的水果、蔬菜表面经常可以发现酵母菌的存在。酵母菌是兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵（反应简式 2），可用于酿酒、制作馒头和面包等。温度是影响酵母菌生长的重要因素，酿酒酵母的最适生长温度约为 $\pu{28^{\circ}C}$。

许多新鲜水果（如葡萄）的果皮表面附着有大量的不同种类的野生酵母菌。在这些酵母菌的作用下，水果可以发酵成果酒。在有氧的条件下，果酒经醋酸菌的作用还可以进一步发酵成果醋。

醋酸菌是好氧细菌，当 $\ce{O2}$、糖源都充足时能通过复杂的化学反应将糖分解成乙酸（反应简式 3）；当缺少糖源时则直接将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为乙酸（反应简式 4）。醋酸菌可用于制作各种风味的醋。多数醋酸菌的最适生长温度为 $\pu{30 \sim 35^{\circ}C}$。

关键易错点辨析：酵母菌酿酒时，初期需要通气，目的是让酵母菌进行有氧呼吸，快速繁殖增加菌体数量（酶和发酵技术的基础是生物量的积累）；后期则必须密封，创造无氧环境，促使其进行酒精发酵。而醋酸菌是严格好氧菌，无论是利用糖源还是酒精发酵成醋，全过程都必须不断通入无菌空气，否则菌种会死亡。

在上述传统发酵食品的制作过程中，我们没有接种菌种，而是利用了天然存在的菌种。菌种差异、杂菌情况不明和发酵过程的控制缺乏标准等，往往会造成发酵食品的品质不一。为了缩短发酵时间，确保品质稳定，工业上大规模生产时，通常会先通过微生物培养技术获得单一菌种，再将它们接种到物料中进行发酵。

微生物培养技术

微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称，包括细菌、真菌和病毒等。本章中提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。在实验室培养微生物，一方面要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件；另一方面要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。

人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质——培养基（culture medium），用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。其中，不含凝固剂（如琼脂）、呈液体状态的培养基为液体培养基，呈固体状态的培养基为固体培养基。在液体培养基中加入琼脂后制成的琼脂固体培养基，是实验室中最常用的培养基之一。微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落（colony）。

补充：琼脂（Agar）作为凝固剂的特性：琼脂是从红藻中提取的多糖，它作为凝固剂有两个得天独厚的优势：

1. 大多数微生物无法利用：不会因为被微生物分解而导致培养基液化。
2. 特殊的物理性质：熔点约为 $\pu{96 ^{\circ}C}$，而凝固点约为 $\pu{40 ^{\circ}C}$。这意味着我们可以将熔化的培养基冷却到 $\pu{50 ^{\circ}C}$ 左右（手感温热）再进行倒平板操作，既不会烫死菌种（针对混合倒板法），又能保持液态。

指南：固体、液体还是半固体？——培养基物理形态的选择：选择培养基的物理形态主要取决于实验目的。简单来说：如果目的是“找个体/纯化”，选固体；如果目的是“要产量/测数据”，选液体。

1. 固体培养基（Solid Medium）：在液体培养基中加入了凝固剂（通常是 $1.5\% \sim 2.0\%$ 的琼脂）。核心功能是分离与固定。适用于：

   • 分离纯化：将混杂的细菌分开，长出独立的单菌落（Colony）。
   • 菌种鉴定：观察菌落的形态、颜色、大小、边缘形状等特征。
   • 菌种保存：做成试管斜面，用于短期或中期保存菌种。
   • 计数：利用稀释涂布平板法计算样品中的活菌数（CFU 计数）。

2. 液体培养基（Liquid Medium / Broth）：不加琼脂，呈流体状。核心功能是增殖与均一化。适用于：

   • 富集培养：让少量细菌快速繁殖，液体环境营养接触更充分，生长更快。
   • 工业发酵/产物提取：获得大量菌体，或提取分泌到培养液中的蛋白、抗生素等。
   • 生理生化测定：如测定生长曲线（OD 值），液体环境均一，适合分光光度计检测。
   • 耐药性初筛：在肉汤中添加抗生素，观察是否变浑浊。

3. 半固体培养基（Semi-solid Medium）：琼脂含量较少（通常为 $0.3\% \sim 0.5\%$）。其特点是细菌可以在内部运动，但不会像液体那样产生剧烈对流。适用于：

   • 观察动力（Motility）：有鞭毛的细菌会在半固体内部游动使培养基变浑浊，无鞭毛者仅沿穿刺线生长。
   • 微需氧菌培养：调节不同深度的氧气含量，适合对氧气敏感的细菌。
   • 噬菌体实验：双层平板法中上层常用半固体，方便噬菌体扩散形成空斑。

4. 特殊的“培养基”：

   • 活体培养基（Living Host Systems）：针对某些绝对寄生的微生物（如病毒、衣原体）。例如使用鸡胚（鸡蛋）生产流感疫苗，或利用动物细胞株进行培养。
   • 双相培养基（Biphasic Medium）：容器内既有固体又有液体。如 Castaneda 瓶中底部为固体斜面，底部存有液体肉汤，常用于血液细菌培养，减少因反复转移导致的污染。
   • 气 - 液界面培养（Air-Liquid Interface, ALI）：细胞底部接触培养液，顶部暴露于空气，模拟气管、皮肤等组织的真实生理环境。

虽然各种培养基的配方不同，但一般都含有水、碳源（提供碳元素的物质）、氮源（提供氮元素的物质）和无机盐等营养物质。牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。

深度拓展：碳氮比（C/N）的调控：在发酵工程中，培养基中碳源和氮源的比例（C/N）对微生物的代谢途径มี重要影响，这是竞赛和大学微生物学的考点：

• 高 C/N（氮源相对缺乏）：有利于真菌的生长，或者促进微生物积累细胞内储藏物质（如油脂、多糖）。
• 低 C/N（氮源相对充足）：有利于细菌的生长，或者促进蛋白质（如菌体蛋白、酶）和核酸的合成。

在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对 $\ce{pH}$、特殊营养物质以及 $\ce{O2}$ 的需求。例如，在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；在培养霉菌时，一般需要将培养基调至酸性；在培养细菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性；在培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。

获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括消毒和灭菌。

消毒（disinfection）是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。

灭菌（sterilization）则是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。

消毒和灭菌工作主要包括两个方面：对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。常用的消毒方法有煮沸消毒、巴氏消毒等；灭菌方法有湿热灭菌、干热灭菌和灼烧灭菌等。

一表通关：消毒与灭菌的对比

项目	消毒（Disinfection）	灭菌（Sterilization）
程度	相对温和	强烈、彻底
结果	杀死多种微生物，不包括芽孢和孢子	杀死所有微生物，包括芽孢和孢子
适用对象	操作空间、皮肤、水源、不耐热液体（牛奶）	玻璃器皿、接种工具、培养基
常用方法	巴氏消毒、紫外线、酒精、煮沸	高压蒸汽、干热、灼烧

做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。

• 生物消毒法：是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。例如，有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。

• 消毒：

  • 日常生活中经常用到煮沸消毒法。在 $\pu{100 ^{\circ}C}$ 煮沸 $\pu{5 \sim 6 min}$，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
  • 对于一些不耐高温的液体，如牛奶，则可使用巴氏消毒法，即在 $\pu{63 \sim 65 ^{\circ}C}$ 消毒 $\pu{30 min}$ 或 $\pu{72 \sim 76 ^{\circ}C}$ 处理 $\pu{15 s}$ 或 $\pu{80 \sim 85 ^{\circ}C}$ 处理 $\pu{10 \sim 15 s}$，可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且基本不会破坏牛奶的营养成分。
  • 此外，人们也常使用化学药物进行消毒，如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。
  • 除了以上方法，还常用紫外线进行消毒。例如，接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射 $\pu{30 min}$，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒苯酚或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。

• 湿热灭菌：

  • 这是一种利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。其中高压蒸汽灭菌的效果最好。
  • 实验室常用的高压蒸汽灭菌锅就是以水蒸气为介质，在压力为 $\pu{100 kPa}$、温度为 $\pu{121 ^{\circ}C}$ 的条件下，维持 $\pu{15 \sim 30 min}$ 来灭菌的。
  • 注意：使用高压蒸汽灭菌锅时，必须排尽锅内的冷空气。如果冷空气没有排尽，即使压力表显示达到了 $\pu{100 kPa}$，内部温度也达不到 $\pu{121 ^{\circ}C}$，从而导致灭菌失败。

• 干热灭菌：

  • 将灭菌物品放入密闭容器如干热灭菌箱，在 $\pu{160 \sim 170 ^{\circ}C}$ 的热空气中维持 $\pu{1 \sim 2 h}$ 可以达到灭菌的目的。
  • 耐高温的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等，可以采用这种方法灭菌。

• 灼烧灭菌：

  • 将微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。
  • 此外，在接种过程中，试管口、瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌。

微生物的纯培养

在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。

微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。下面我们以酵母菌的纯培养为例，通过实际操作来学习微生物纯培养技术。

分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。

应试与实操：倒平板与接种环灼烧：

1. 倒平板的细节：灭菌后的培养基需冷却至 $\pu{50 ^{\circ}C}$ 左右才能倒平板。操作应在酒精灯火焰旁进行。倒完平板后需立即倒置，防止皿盖上的冷凝水滴落污染培养基。

2. 接种环灼烧次数：如果划线分区为 $N$ 个区，则总共需要灼烧 $N+1$ 次。

   • 第一次：接种前，保证接种环无菌。
   • 中间 $N-1$ 次：每次划完一个区后，灼烧接种环杀死残留菌种，冷却后从上一次划线的末端开始划线，实现菌种的逐步稀释。
   • 最后一次：划线结束后，灼烧接种环，防止污染环境和操作者。

深入：培养皿与培养基的灭菌流程：针对固体培养基的培养皿灭菌及制备，主要分为空培养皿的灭菌和培养基的灭菌两个部分。目前实验室主要使用两种培养皿：一次性塑料培养皿和玻璃培养皿，它们的处理流程完全不同。

1. 一次性塑料培养皿（目前最主流）：不需要实验室自行灭菌。这些培养皿在出厂前已经通过环氧乙烷或γ 射线进行了灭菌处理，并密封在塑料包装中。使用时只需在超净台内拆开包装即可。严禁放入高压灭菌锅，否则会融化变形。

2. 玻璃培养皿（传统或特定需求）：清洗后沥干，用报纸或牛皮纸将若干个包成一筒，或直接放入专用金属灭菌筒中。推荐使用干热灭菌，即放入电热干燥箱中，在 $\pu{160 ^{\circ}C}$ 维持 $\pu{2 h}$（或 $\pu{170 ^{\circ}C}$ 维持 $\pu{1 h}$）。灭菌后玻璃干燥无冷凝水，便于储存。也可使用高压蒸汽灭菌锅（$\pu{121 ^{\circ}C}$，$\pu{15 \sim 20 min}$），但灭菌后需要烘干。

3. 培养基的灭菌：将配制好的培养基（含琼脂）装入锥形瓶，封口后放入高压蒸汽灭菌锅。标准条件为 $\pu{121 ^{\circ}C}$（约 $\pu{100 kPa}$），维持 $\pu{15 \sim 20 min}$。含糖类等热敏物质的培养基可能需要降低温度（如 $\pu{115 ^{\circ}C}$）或分别灭菌后混合。

4. 倒平板操作要点：在超净工作台中进行，提前开启紫外线灯杀菌 $\pu{15 \sim 30 min}$，操作时关闭紫外灯、开启风机。如果没有超净台，需在酒精灯火焰旁操作。培养基冷却至 $\pu{50 ^{\circ}C}$ 左右（手背触碰瓶壁感到温热但不烫），左手打开皿盖一条缝，右手将培养基倒入（通常 $\pu{15 \sim 20 mL}$，铺满底部约 $\pu{3 \sim 5 mm}$ 厚），迅速盖上盖子，轻轻平晃使培养基铺匀。待完全凝固后倒置存放，防止冷凝水滴落污染培养基。

辨析：酒精灯火焰旁操作 vs 无菌舱操作：在没有现代化无菌设备的传统微生物实验中，酒精灯是核心防线。其意义主要有三点：

1. 制造“无菌保护伞”：火焰周围的空气受热膨胀上升，形成一股向上的热对流气流，把周围空气中的灰尘、微生物孢子“推开”或带向高处，防止它们沉降到敞口的培养皿或试管中。在火焰周围 $\pu{10 \sim 15 cm}$ 的范围内形成了一个相对无菌的空间。

2. 管口/瓶口灭菌：在打开试管或烧瓶的瞬间，通过将管口快速通过火焰，可以利用热气流防止外部空气携菌进入，同时杀灭管口边缘可能沾染的杂菌。

3. 工具的即时灭菌：接种环、接种针、镊子等金属工具，需要在操作前后直接在火焰上灼烧灭菌（烧红）。

如果已有合格的超净工作台或生物安全柜，酒精灯的作用不仅变得多余，甚至可能带来负面影响。无菌舱通过 HEPA 过滤器吹出垂直或水平的层流洁净风，像一道“气幕”不断将污染物吹离工作区，本身就提供了比火焰范围大得多的无菌环境。现代实验室多使用一次性无菌耗材（塑料接种环、移液枪头）或红外线灭菌器来加热金属工具，无需明火。

在无菌舱内使用酒精灯的潜在危害：（1）破坏层流——酒精灯产生的热气流是向上的，而安全柜的气流通常是垂直向下的，热气流会干扰层流，产生湍流，使无菌保护失效；（2）损坏滤网——长期在滤网下方燃烧火焰，高温可能损坏昂贵的 HEPA 高效过滤器；（3）安全隐患——无菌舱内空间狭窄，且可能有酒精喷雾消毒残留，明火极易引发火灾或爆炸。

结论：酒精灯是“便携版”的无菌控制手段；当拥有真正的无菌舱时，酒精灯往往就成了干扰气流的累赘。在普通实验桌（开放环境）上操作必须使用酒精灯；在超净工作台/生物安全柜内操作原则上不需要、也不建议使用酒精灯。

选择培养和计数

自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。

补充：富集培养（Enrichment Culture）：在进行分离之前，如果目标菌数量很少，通常先进行富集培养。利用液体培养基，给予目标菌特定的生长条件（如特定碳源、pH 或温度），抑制其他菌生长，从而使目标菌在数量上占据优势。注意富集培养通常使用液体培养基，且不用于计数。

地球上的植物每年产生的纤维素超过 70 亿吨，其中 $40\% \sim 60\%$ 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。

已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈。

绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。反刍动物，如牛和羊，具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。

尿素 $\ce{CO(NH2)2}$ 含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成 $\ce{NH3}$，$\ce{NH3}$ 再转化为 $\ce{NO3-}$、$\ce{NH4+}$ 等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生 $\ce{NH3}$，$\ce{NH3}$ 可作为细菌生长的氮源。

如果想知道 $\pu{1g}$ 土壤中有多少能分解尿素的细菌，仅有选择培养基是不够的，还需要对土样进行适当的处理以及科学的测定微生物数量的方法。由于土壤中细菌的数量庞大，要想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须要对土样进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上，也就是要采用稀释涂布平板法。

稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数为 $30 \sim 300$ 的平板进行计数。

样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为 $30 \sim 300$、适于计数的平板。在同一稀释度下，应至少对 3 个平板进行重复计数，然后求出平均值。

细菌计数板和血细胞计数板的计数原理相同。血细胞计数板比细菌计数板厚，常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。用细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。

活菌计数技术广泛应用于食品卫生、水源污染度的检验和土壤含菌量的测定等方面。值得注意的是，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。

除上述的活菌计数外，利用显微镜进行直接计数，也是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。

核心考点：两种计数方法的比较

方法	显微镜直接计数法	稀释涂布平板法
原理	利用血细胞计数板在显微镜下直接观察计数	依据“菌落形成单位”（CFU），一个菌落代表一个活菌
对象	死菌 + 活菌（除非使用台盼蓝染色等区分）	活菌（仅活菌能形成菌落）
结果偏差	往往偏大（混杂了死菌和杂质）	往往偏小（两个菌连在一起算一个菌落）
特点	快速、直观，但无法区分死活	结果准确度较高，但操作繁琐，需等待培养

微生物菌种的高通量筛选：在自然界中，微生物的种类远远超过动植物的种类。科学家预测，目前在实验室里能够培养的微生物的种类还不到自然界中存在的微生物种类的 $1\%$，甚至更低。在如此庞大的微生物王国里，研究者如何获得目标菌种呢？

过去，人们通过手工操作来进行筛选，不仅费时费力，而且大大限制了筛选量。微生物菌种的高通量筛选以有多个小孔的微孔板为载体，采用自动化的操作系统，并以灵敏、快速的检测仪器采集实验数据，用计算机分析处理数据，从而实现了在同一时间对上千份，甚至上万份的样品进行筛选。筛选的对象可以是从自然界分离的菌株，可以是诱变产生的菌株，也可以是通过生物技术改造的菌株。

以高通量筛选某种高产突变菌种为例。研究人员首先会将经诱变处理的菌液分成上千份，然后把它们全部接种到含有培养基的微孔板中培养，一段时间后检测培养物中产物的产量，再挑选高产的菌株进行复筛……在这个过程中，最关键的是建立高通量的培养和分析检测平台。研究人员往往需要开发合适的培养基，对微生物进行微型化培养以及利用多种检测技术来测定菌株的各项生理生化指标等。目前，已经开发出了一些微型生物反应器，它们就像一套小型的发酵罐，体积一般小于 $\pu{100 mL}$，能实现对 $\ce{pH}$、溶解氧等重要发酵参数的实时监测。

一套理想的微生物菌种高通量筛选流程是高度自动化和集成化的，整个流程中培养基的制备和分装、菌液的稀释和涂布、菌体的培养和保藏、单克隆的识别和挑选、微生物及其代谢物的分析和检测以及数据的集成和管理等环节都体现着高通量技术的应用。虽然目前离这个目标还有一定的距离，筛选的装置和技术也都还要不断改进，但是微生物菌种的高通量筛选无疑是微生物研究领域的一场技术革命，也是研究成果走向工程化发展道路的强大催化剂。除了微生物菌种的高通量筛选，高通量筛选技术还在微生物药物的筛选方面发挥了积极的作用。

发酵工程与应用

随着人们对发酵原理的认识，微生物纯培养技术的建立，以及密闭式发酵罐的成功设计，人们能够在严格控制的环境条件下大规模生产发酵产品，发酵工程逐步形成。发酵工程与农业、食品工业、医药工业及其他工业生产有着密切的联系。

发酵工程的一般步骤

发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产物的分离、提纯等方面：

1. 选育菌种：性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。

   • 生产柠檬酸就需要筛选产酸量高的黑曲霉。
   • 在啤酒生产中，使用基因工程改造的啤酒酵母，可以加速发酵过程，缩短生产周期。

2. 扩大培养：工业发酵罐的体积一般为几十立方米到几百立方米，接入的菌种总体积需要几立方米到几十立方米。所以，在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养。

3. 配制培养基：在菌种确定之后，要选择原料制备培养基。在生产实践中，培养基的配方要经过反复试验才能确定。

4. 灭菌：发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种。一旦有杂菌污染，可能导致产量大大下降。

   • 例如，在青霉素生产过程中如果污染了杂菌，某些杂菌会分泌青霉素酶将青霉素分解掉。因此，培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。

5. 接种：现代发酵工程使用的大型发酵罐均有计算机控制系统，能对发酵过程中的温度、$\ce{pH}$、溶解氧、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制；还可以进行反馈控制，使发酵全过程处于最佳状态。

6. 发酵：这是发酵工程的中心环节。

   • 在发酵过程中，要随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。
   • 还要及时添加必需的营养成分，要严格控制温度、$\ce{pH}$ 和溶解氧等发酵条件。环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且会影响微生物代谢物的形成。
   • 典型实例：谷氨酸的发酵生产——在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸；在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和 N-乙酰谷氨酰胺。

7. 分离、提纯产物：

   • 如果发酵产品是微生物细胞本身（如单细胞蛋白），可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥，即可得到产品。
   • 如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品（如萃取、离子交换、层析等）。

发酵工程以其生产条件温和、原料来源丰富且价格低廉、产物专一、废弃物对环境的污染小和容易处理等特点，在食品工业、医药工业和农牧业等许多领域得到了广泛的应用，形成了规模庞大的发酵工业。

在食品工业上的应用

食品工业是微生物最早开发和应用的领域。一直以来，与发酵有关的食品工业的产量和产值都居于发酵工业的首位。在我们的日常生活中，利用发酵工程生产的食品以及与食品有关的产品比比皆是，主要包括以下三个方面。

1. 生产传统的发酵产品：

   • 例如，以大豆为主要原料，利用产生蛋白酶的霉菌（如黑曲霉），将原料中的蛋白质水解成小分子的肽和氨基酸，然后经淋洗、调制成的酱油产品。
   • 以谷物或水果等为原料，利用酿酒酵母发酵生产的各种酒类。发酵工程使这些产品的产量和质量明显提高。

2. 生产各种各样的食品添加剂：

   • 随着生活水平的提高，人们对食品的需求越来越多样化，食品添加剂应运而生，它不仅可以增加食品的营养，改善食品的口味、色泽和品质，有时还可以延长食品的保存期。许多食品添加剂都能通过发酵工程生产。
   • 例如，柠檬酸是一种广泛应用的食品酸度调节剂，它可以通过黑曲霉的发酵制得。
   • 由谷氨酸棒状杆菌发酵可以得到谷氨酸，谷氨酸经过一系列处理就能制成味精。

3. 生产酶制剂：

   • 在食品工业中，我们还会经常用到一些酶制剂，如 $\alpha$-淀粉酶、$\beta$-淀粉酶、果胶酶、氨基肽酶和脂肪酶等。目前，已有 50 多种酶制剂成功用于食品的直接生产、改进生产工艺、简化生产过程、改善产品的品质和口味、延长食品储存期和提高产品产量等方面。
   • 这些酶制剂除少数由动植物生产外，绝大多数也是通过发酵工程生产的。

工艺拓展：啤酒的生产：啤酒的工业化生产流程中，发酵过程分为主发酵和后发酵两个阶段。

• 主发酵：酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成都在此阶段完成。
• 后发酵：主发酵结束后，发酵液还不适合饮用，要在低温、密闭的环境下储存一段时间进行后发酵，这样才能形成澄清、成熟的啤酒。

在医药工业上的应用

青霉素是世界上第一种应用于临床的抗生素。早期科学家只能从青霉菌中提取少量青霉素，它的价格贵如金。随着高产菌种的选育、发酵技术的发展等，青霉素步入了产业化生产的道路。青霉素的发现和产业化生产推动了发酵工程在医药领域的应用和发展。之后，发酵工程逐步扩展到了其他抗生素、多种氨基酸、激素和免疫调节剂等的生产领域。

近些年来，基因工程、蛋白质工程等的广泛应用给发酵工程制药领域的发展注入了强劲动力。人们可以采用基因工程的方法，将植物或动物的基因转移到微生物中，获得具有某种药物生产能力的微生物；或者直接对菌种进行改造，再通过发酵技术大量生产所需要的产品。

• 生长激素释放抑制激素：能够抑制生长激素的不适宜分泌，可用于治疗肢端肥大症。最初临床上使用的这种激素是从羊脑中提取的，50 万个羊脑才能提取 $\pu{5 mg}$，远远不能满足需要。后来利用经过基因改造的微生物进行发酵生产，从 $\pu{7.5 L}$ 培养液中就能得到 $\pu{5 mg}$ 的生长激素释放抑制激素，这也使得其价格降为原来的几百分之一。
• 其他药物：未来甚至还可能用微生物来生产过去只能从植物中分离提取的紫杉醇、青蒿素前体等化合物。
• 疫苗：科学家还利用基因工程，将病原体的某个或某几个抗原基因转入适当的微生物细胞，获得的表达产物就可以作为疫苗使用。例如，一种生产乙型肝炎疫苗的方法就是将乙型肝炎病毒的抗原基因转入酵母菌，再通过发酵生产。

前沿衔接：PCR 技术与工程菌检测：在医药工业中，为了确保基因工程菌（如生产胰岛素的大肠杆菌）的质粒不丢失、基因不突变，经常需要用到 PCR（聚合酶链式反应） 技术进行快速检测。PCR 技术可以在体外短时间内大量扩增目的基因，是现代生物工程的“金标准”检测手段之一。

在农牧业上的应用

从自然界选育出优良菌株，再通过发酵工程大规模发酵生产制成的活菌或其代谢物产品等正应用于现代农牧业的很多方面。

1. 生产微生物肥料：

   • 微生物肥料利用了微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长，常见的有根瘤菌肥、固氮菌肥等。
   • 有的微生物肥料还可以抑制土壤中病原微生物的生长，从而减少病害的发生。

2. 生产微生物农药：

   • 与传统的化学农药不同，微生物农药是利用微生物或其代谢物来防治病虫害的。
   • 例如，苏云金杆菌可以用来防治 80 多种农林虫害；利用白僵菌可以防治玉米螟、松毛虫等虫害；一种放线菌产生的抗生素——井冈霉素可以用于防治水稻纹枯病。
   • 微生物农药作为生物防治的重要手段，将在农业的可持续发展方面发挥越来越重要的作用。

3. 生产微生物饲料：

   • 研究表明，微生物含有丰富的蛋白质，如细菌的蛋白质含量占细胞干重的 $60\% \sim 80\%$，而且细菌生长繁殖速度很快。因此，许多国家以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得了大量的微生物菌体，即单细胞蛋白。
   • 用酵母菌等生产的单细胞蛋白可以作为食品添加剂；用单细胞蛋白制成的微生物饲料，能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提高。
   • 另外，在青贮饲料中添加乳酸菌，可以提高饲料的品质，使饲料保鲜，动物食用后还能提高免疫力。

在其他方面的应用

随着对纤维素水解研究的不断深入，利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质已取得成功。自然界中还存在着一定数量的极端微生物，它们能在各种极端恶劣的环境（如高温、高压、高盐和低温等环境）中正常生活，对它们的研究已成为国际热点，其中一些极端微生物已应用于生产实践。例如，嗜热菌、嗜盐菌可以用来生产洗涤剂，嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量。

通过微生物发酵，可以将粮食（如玉米、小麦等）及各种植物纤维加工成燃料乙醇；将燃料乙醇和普通汽油按一定比例混配，就形成了目前在我国多地广泛使用的乙醇汽油。

• 乙醇汽油的环保性令人称道。调查显示，使用乙醇汽油与使用普通汽油相比，排放到空气中的 $\ce{NO2}$、$\ce{CO}$ 等均有不同程度下降。

• 有人认为燃料乙醇“可再生”；但也有人认为，生产燃料乙醇需要消耗大量粮食，会增加粮食短缺的风险。因此，利用秸秆、玉米芯等非粮生物质原料生产燃料乙醇（第二代生物燃料）是未来的重要发展方向。

泡菜与酸菜发酵的微生物学

泡菜和酸菜的发酵过程，本质上是一场“微生物的更替战争”。在不同的酸度和含氧量环境下，不同的细菌会轮流坐上“霸主”的位子。理解这一过程，对于理解发酵工程中的菌种竞争、选择性培养等概念大有裨益。

发酵的启动与菌种演替

做酸菜时，新鲜蔬菜通常建议加到缸的 $80\% \sim 90\%$ 满。千万不要装到十分满，原因如下：

1. 预留压缸石的空间：蔬菜必须完全浸泡在水面以下，不能接触空气，否则容易生白花（霉菌）或腐烂。通常需要在蔬菜上面压一块石头或重物，如果装得太满，石头就会高出缸口，无法密封。

2. 防止发酵过程中液体溢出：发酵初期，乳酸菌和其他微生物活跃，会产生少量 $\ce{CO2}$。气泡会在蔬菜间隙中产生并向上推，导致整体体积有轻微膨胀。如果装得太满，酸水会被顶出缸外。

3. 保证盐水能完全覆盖蔬菜：需要留出“安全距离”，让最上面的蔬菜与空气之间有一层厚厚的水层阻隔。

盐水的科学作用：加盐水不仅仅是为了给菜增加“咸味”，它在发酵科学中扮演着“守门员”和“催化剂”的角色：

1. “筛选”细菌：这是最核心的作用。导致蔬菜腐烂、发霉的杂菌（如腐败菌、霉菌）通常耐盐性很差，高浓度盐水会使这些坏细菌脱水死亡。而乳酸菌对盐有一定的耐受力，等于人为制造了一个“只有乳酸菌能生存”的特殊环境。

2. 利用渗透压保持口感：盐水具有高渗透压，能把蔬菜细胞内的水分“吸”出来，让蔬菜的组织结构变得更加紧密，腌出来的酸菜吃起来才会脆爽。如果不加盐或盐太少，蔬菜中的果胶酶会保持活性，导致酸菜变软、发粘。

3. 为乳酸菌提供“食物”：在高渗透压作用下，蔬菜内部的汁液（含有葡萄糖、果糖等）会渗出到盐水中。乳酸菌“吃”掉这些糖，将其转化为乳酸。

通常酸菜的盐水浓度控制在 $2\% \sim 5\%$ 之间比较合适。

正常发酵的菌种演替

泡菜发酵是一个由“产气菌”打头阵，随后由“产酸菌”接管并统治全场的过程：

1. 发酵初期（第 $1 \sim 3$ 天）——启动期：坛子里还有微量的氧气，盐度刚起作用，酸度还很低。此时是混战阶段，也是亚硝酸盐产生的“高峰期”。

   • 优势菌种：肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）。它是泡菜发酵的先锋，耐盐，生长快。它属于“异型乳酸发酵”，不仅产生乳酸，还产生 $\ce{CO2}$（坛子边缘冒气泡的原因）和微量乙醇（香味的来源）。它为后续的强酸菌创造了厌氧和微酸的环境。

   • 次优势菌/竞争菌：大肠杆菌群（Coliforms）、假单胞菌（Pseudomonas）等杂菌。这些不受欢迎的菌会利用蔬菜的硝酸盐还原成亚硝酸盐。好在肠膜明串珠菌会迅速产酸抑制这些杂菌的生长。

2. 发酵中期（第 $4 \sim 10$ 天）——成熟期（最佳食用期）：随着酸度增加，不耐酸的细菌纷纷死亡，真正的“产酸主力”登场。泡菜在这个阶段口感最脆、风味最好。

   • 绝对优势菌种：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。它属于“同型乳酸发酵”，产酸能力极强，能迅速将糖分转化为大量乳酸。它非常耐酸，迅速降低 pH 值，杀灭绝大多数病原菌和杂菌。

   • 次优势菌：短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）等，辅助产酸并贡献风味。

3. 发酵后期（15 天以后）——过酸期：如果泡菜放置过久，酸度极高（pH 值降到 $3.0 \sim 3.5$ 以下）。植物乳杆菌依然坚挺但活性下降。当乳酸菌把糖分吃光，酸度太高连乳酸菌自己都受到抑制时，如果密封稍有不好，耐酸的酵母菌就会开始繁殖，分解乳酸，导致酸度下降，泡菜变软、口味变劣。

发酵失败的情况

如果操作不当（沾了油、密封不严、盐太少），“坏人”就会成为优势菌：

1. 生“白花”（液面出现白色膜状物）：这是最常见的失败现象，通常是因为接触了空气或盐度过低。

   • 优势菌种（坏菌）：产膜酵母（Film-forming Yeasts），如毕赤酵母（Pichia）、汉逊酵母（Hansenula）、假丝酵母（Candida）。它们是好氧菌，会分解乳酸，使酸水变得不酸，且伴有发霉的味道。

2. 腐烂、发臭、变软化水：这是严重的杂菌污染，绝对不能吃。

   • 优势菌种（坏菌）：假单胞菌属（Pseudomonas）分解蛋白质产生恶臭；芽孢杆菌属（Bacillus）某些种类会产生果胶酶，分解蔬菜的果胶导致泡菜软烂如泥。如果看到长毛了（黑色、绿色、红色的毛），那就是霉菌，整坛必须扔掉。

3. 产生“滑腻”感（起黏液）：泡菜水变得像鼻涕一样粘稠。原因是肠膜明串珠菌（前期的好菌）或某些芽孢杆菌，如果温度过高或蔗糖含量过高，它们会过度繁殖并产生大量的葡聚糖（Dextran），这是一种粘性多糖。

亚硝酸盐的“过山车”曲线：大家都怕亚硝酸盐，但很多人不知道它最后去哪了：

• 来源：蔬菜自带硝酸盐 $\to$ 杂菌（大肠杆菌等）将其还原为有毒的亚硝酸盐。
• 峰值：通常在腌制的第 $3 \sim 7$ 天达到最高峰（此时千万别吃，最毒）。
• 降解：第 8 天后开始下降，21 天后基本消失。
• 降解机制：乳酸菌拥有亚硝酸盐还原酶系统，利用亚硝酸盐作为氮源进行代谢，或者在酸性环境下将其降解为一氧化氮等无害气体。

结论：泡菜只有两个时间点最安全——刚泡进去的 2 小时内（“跳水泡菜”）或者泡透了 20 天以后。中间段是危险区。

传统发酵的深层原理

1. 老卤水（母水）的作用：新起坛子很难成功，倒一碗“老酸水”，成功率大增。这在科学上叫“人工接种”。老卤水中含有极高密度的活性乳酸菌（每毫升数亿个）。如果不加老卤，靠蔬菜自带的野生乳酸菌繁殖，需要很长的“迟滞期”（Lag Phase），这期间杂菌容易抢跑。

2. 加白酒的化学反应：很多配方要求加一点高度白酒。酒精（乙醇）和发酵产生的乳酸会发生酯化反应，生成乳酸乙酯——一种具有水果香味的物质，是泡菜独特风味的来源之一。同时，酒精对产膜酵母有更强的抑制作用。

3. 井水 vs 自来水：自来水中含有余氯（杀菌剂），会杀灭乳酸菌。而井水通常是“硬水”，富含 $\ce{Ca^2+}$。钙离子会像桥梁一样连接两根果胶分子链，形成“蛋盒结构”（Egg-box model），极大地增强了细胞壁的机械强度，这正是酸菜“嘎嘣脆”的原因。

4. 细菌素（Bacteriocins）：乳酸菌能打败杂菌，除了靠“酸”这个环境武器，还有“定向导弹”——植物乳杆菌等菌种会分泌一种名为细菌素的多肽（如 Nisin）。它能特异性地在腐败菌的细胞膜上打孔，让坏细菌“漏气”而死。

5. 群体感应（Quorum Sensing, QS）：细菌会分泌信号分子。当菌群密度达到一定阈值，信号分子浓度足够高，所有细菌会同时接收到信号，瞬间开启某些基因表达。乳酸菌通过群体感应，统一协调“产酸”或“分泌细菌素”的节奏。如果菌群密度不够（比如没加老卤），无法触发 QS 机制，战斗力就会大打折扣。

乳酸菌的代谢途径

从生物化学的角度看，酸菜里发生的是什么反应？

1. 同型发酵（EMP 途径）：植物乳杆菌走这条路。

特点：转化率极高，理论上糖分 $100\%$ 转化为乳酸，产酸快，不产气。

1. 异型发酵（PK 途径/HMP 途径）：肠膜明串珠菌走这条路。

特点：产酸效率低，但产气（让坛沿水咕嘟咕嘟响）、产酒香。

完美的酸菜是 EMP 途径和 PK 途径的完美配合：前期靠 PK 途径造香气、造气体排氧；中后期靠 EMP 途径疯狂产酸防腐。

微生物纯培养技术详解

微生物的纯培养（Pure Culture）是从复杂的微生物混合群体中，分离出由单一细胞繁殖而成的后代群体的过程。简言之：纯度 $=100\%$ 的克隆体。

平板划线法的原理

平板划线（Streak Plate Method）的核心目的是：把混在一起的一大团微生物“画”散开，直到让它们变成单个的细胞，从而长出独立的“单菌落”。

它的原理可以概括为“平面上的稀释”：

1. 第一区：当你用接种环蘸取菌液在平板上划第一道线时，留下的菌非常多，长出来是一片密密麻麻的苔藓状。

2. 第二区、第三区……：关键在于，划完一个区域后，要灼烧灭菌接种环，杀灭环上残留的菌，然后冷却，再去接触上一个区域的末端划下一道线。这样每一次划线，都是从上一次划线中带走少量的菌。

3. 结果：随着划线的进行，接种环上的菌越来越少，最后划出的线条上，菌就会分散成单个的细胞。培养后可以得到独立的单菌落。

为什么必须是“固体”培养基？

• 空间固定（Immobilization）：在液体培养基里，微生物随布朗运动乱跑，你把它分得再开，一秒钟后它们又混在一起了。
• 琼脂的魔力：平板里的琼脂一旦凝固，会形成一个多孔的网格结构。微生物落在哪个坐标点（$x, y$），就被“锁”在那个点上，只能原位分裂。它生出的几百万个后代堆叠在一起，肉眼看就是个圆点。
• 所以，平板划线本质上是利用固体介质实现了“微生物的空间定位技术”。

对数稀释与 CFU：从数学角度看，划线法利用的是几何级数递减（对数稀释）

• 假设第一区接种环带了 $10^6$ 个细胞。
• 通过灼烧灭菌和划线，第二区可能带入了 $10^3$ 个。
• 第三区可能只剩下 $10^1$ 个。

这种对数级（Logarithmic）稀释，保证了无论初始菌浓度多高，只要划的区够多，最后总能得到单个菌。

我们严谨的科学家，指着平板上的一个点，不说“一个细胞”，而说“一个菌落形成单位”（CFU, Colony-Forming Unit）。这是因为，虽然我们希望它源于一个细胞，但偶尔可能会有两个细胞粘在一起落下，长成一个点。

酵母菌与细菌的菌落差异——在划线板上，酵母菌和细菌表现完全不同：

• 气味鉴别：培养好的酵母平板，打开盖子用扇闻法，会有一股极其明显的面包味或淡淡的酒香味。而细菌平板通常是臭袜子味或腥味。

• 形态差异：酵母是真菌，细胞比细菌大得多。

  • 酵母菌落：通常更大、更厚、更白、表面湿润光滑，甚至有点像奶油滴。
  • 霉菌菌落：通常是毛绒绒的（菌丝）。
  • 细菌菌落：通常较小，透明或半透明。

• 时间维度：划线后，大肠杆菌一晚上就能长好；而酵母菌通常需要 $2 \sim 3$ 天（$\pu{28 ^{\circ}C}$）才能长出漂亮的单菌落。

纯培养的验证：如何证明你养的是“纯”的？

• 形态学检查：显微镜下看细胞形状是否均一（革兰氏染色）。

• 菌落特征：平板上所有菌落的大小、颜色、边缘形状必须一致。

• 分子鉴定（进阶）：提取 DNA，跑 PCR 扩增 16S rRNA（细菌）或 ITS（真菌）片段进行测序，这是现代的“金标准”。

纯培养与工业生产

在工业界，纯培养不只是实验，它是资产、是法律、是生命线。

1. 种子扩大培养（Seed Train）：工业发酵罐通常是 $\pu{50 t}$、$\pu{100 t}$ 甚至更大。你不能直接把一试管菌倒进去。

每一步都必须保证绝对纯种。如果第一步混入 1 个杂菌，经过 3 级放大，杂菌可能会压倒生产菌，导致整罐原料报废（数百万损失）。

1. 菌种改良与筛选：工业菌株通常不是自然界的“野种”，而是经过“驯化”的。

   • 诱变育种：用紫外线或化学药剂处理纯培养物，制造突变，然后重新划线分离。
   • 高通量筛选：利用机器人手臂，每天在几千个微孔板上进行微型“纯培养”，寻找产率高出 $1\%$ 的那个“超级突变株”。这 $1\%$ 的提升，对应的是工厂几千万的额外利润。

2. 菌种退化与保存：纯培养物是会“变坏”的。

   • 菌种退化：在试管里传代久了，微生物会变懒（不再产酶或产抗生素），或者发生回复突变。
   • 工业对策：不依赖连续传代，而是建立冷冻干燥（Lyophilization）或液氮超低温（$\pu{-196 ^{\circ}C}$）的菌种库。这是工业企业的核心机密库。

发酵工程核心菌种

在发酵工程中，菌种是核心资产。不同的菌种承担不同的任务。

细菌（Bacteria）：

1. 大肠杆菌（Escherichia coli）

   • 地位：分子生物学的“役马”，基因工程最常用的宿主。
   • 应用：生产重组蛋白（如人胰岛素、生长激素）。
   • 优点：长得快，遗传背景清晰。
   • 缺点：产生的蛋白常形成包涵体（不溶解），且有内毒素。

2. 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

   • 应用：生产淀粉酶、蛋白酶（用于洗涤剂）、杀虫剂。
   • 特点：强大的分泌蛋白能力，被认为是安全的（GRAS）。

3. 谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）

   • 应用：氨基酸工业的霸主，主要生产味精（谷氨酸）、赖氨酸。

4. 乳酸菌（Lactic acid bacteria）

   • 应用：食品发酵（酸奶、泡菜），益生菌制剂。

放线菌（Actinomycetes）：

1. 链霉菌（Streptomyces）

   • 地位：抗生素制造厂。
   • 应用：生产链霉素、土霉素、红霉素等绝大多数抗生素。

酵母菌（Yeasts）——真菌类：

1. 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

   • 应用：传统酿酒、烘焙；现代用于生产乙醇燃料、乙肝疫苗。
   • 特点：真核生物，比细菌更能正确加工复杂的蛋白。

2. 毕赤酵母（Pichia pastoris）

   • 应用：现代发酵工程宠儿，用于高密度发酵生产外源蛋白（如抗体片段）。

霉菌（Molds/Fungi）——真菌类：

1. 黑曲霉（Aspergillus niger）

   • 应用：柠檬酸（可乐里的酸味剂）全球产能 $90\%$ 靠它；酱油酿造（米曲霉）。
   • 特点：酶系极其丰富，分解能力强。

2. 青霉菌（Penicillium）

   • 应用：生产青霉素。

动物细胞（Animal Cells）：CHO 细胞（中国仓鼠卵巢细胞）

• 应用：生物制药金字塔尖。生产单克隆抗体（治疗癌症、自身免疫病）。
• 特点：极难养，成本高，但能对蛋白进行“糖基化”修饰，这对药效至关重要。

培养基中抗生素的应用

在培养基中加入青霉素（Penicillin），根据培养对象的不同，目的通常截然不同。

培养动物细胞：这是最常见的情况。

• 培养对象：哺乳动物细胞（如肿瘤细胞系 HeLa、CHO，或原代细胞）、昆虫细胞等。

• 目的：防止细菌污染（防腐/抑菌）。

• 原理解析：动物细胞培养液营养丰富，极易滋生细菌。青霉素可以抑制细菌细胞壁的合成（主要是革兰氏阳性菌），从而杀死细菌，但不会伤害没有细胞壁的动物细胞。

• 通常做法：很少单独加青霉素，通常是青霉素与链霉素（Streptomycin）混合使用，俗称“双抗”（Pen-Strep）。青霉素杀革兰氏阳性菌，链霉素杀革兰氏阴性菌，两者结合形成广谱抗菌保护。

培养真菌：

• 培养对象：酵母菌、霉菌等真菌。

• 目的：抑制细菌生长，进行选择性分离。

• 原理解析：当需要从土壤、食品或环境样本中分离真菌时，样本中通常混杂着大量细菌。细菌生长速度快，容易覆盖真菌。加入青霉素可以抑制细菌生长，从而让真菌（青霉素对其无效）成为优势菌落长出来。

基因工程中的细菌培养：

• 培养对象：携带了耐药质粒的细菌（通常是大肠杆菌 E. coli）。

• 目的：筛选转化子（筛选标记）。

• 原理解析：在基因工程中，我们想把外源基因导入细菌。我们会将这段基因连在一个载体（质粒）上，这个质粒上通常带有一个抗性基因（如氨苄青霉素抗性基因 AmpR）。只有成功转入了质粒的细菌才能在含有青霉素/氨苄青霉素的培养基上存活，没有转入质粒的细菌会被杀死。

简单总结：当你看到培养基里加了青霉素，先看养的是什么：

• 养的是细胞 $\to$ 目的是防污染（它是保镖）。
• 养的是真菌 $\to$ 目的是除杂菌（它是除草剂）。
• 养的是大肠杆菌 $\to$ 目的是筛选（它是考官，只有带“准考证/质粒”的才能活）。

抗生素应用的深层知识：青霉素的“保质期”只有几天

• 常识误区：很多人以为配好的双抗培养基放在冰箱里一个月还能杀菌。
• 事实：青霉素在水溶液中非常不稳定，尤其是在 $\pu{37 ^{\circ}C}$ 培养箱中。它的半衰期通常只有 $2 \sim 3$ 天。
• 操作启示：如果你养细胞连续 3 天没换液，此时培养基里的青霉素基本已经失效了。必须定期换液，不仅是为了补充营养，也是为了刷新抗生素的“战斗力”。

它只杀“正在干活”的细菌

• 原理深化：青霉素的靶点是细菌细胞壁合成酶（转肽酶）。它不是直接溶解细胞壁，而是阻断新的细胞壁合成。
• 关键推论：青霉素对休眠期的细菌无效（因为休眠菌不合成细胞壁）。如果培养体系里混入了处于“休眠状态”的细菌，青霉素杀不死它们。一旦环境改变，这些细菌会突然“复活”爆发。

工业生产通常“不敢加”青霉素：在实验室我们加青霉素是为了省事（防污染），但在工业生产（如生产抗体药、疫苗）中，目标是无抗生素生产：

• 过敏风险：如果最终药物里残留微量青霉素，注射给对青霉素过敏的病人，会导致休克甚至死亡。
• 法规限制：FDA 和 NMPA（药监局）对生物制品中的抗生素残留有极严格的限制。
• 工业做法：工业级的大规模细胞培养（几千升的罐子）通常要求绝对无菌操作，培养基里往往不加青霉素。这倒逼了工业界必须具备比实验室高得多的无菌控制水平。

卫星菌落（Satellite Colonies）现象：

• 在做基因工程筛选（用氨苄青霉素 Ampicillin）时，你会发现一个大的转化子菌落周围，密密麻麻长了一圈细小的菌落。
• 生物学解释：那个大的中心菌落为了活命，分泌了 $\beta$-内酰胺酶到体外，把周围培养基里的青霉素分解掉了。结果，周围原本该死的杂菌（没有抗性的“蹭饭者”）就趁机长了出来。
• 教训：挑菌落时，千万别挑到旁边的“卫星”，那是假阳性。

支原体——细胞培养的隐形杀手：你加了青霉素，细菌没长，细胞也没变浑浊，但细胞状态就是越来越差。

• 原因：青霉素的作用靶点是细胞壁（肽聚糖）。支原体没有细胞壁！所以青霉素对支原体完全无效。
• 补充知识：实验室里最可怕的污染不是细菌（肉眼可见），而是支原体。加青霉素反而会让你麻痹大意，掩盖无菌操作不规范的问题，导致支原体在细胞间悄悄传播。

β-内酰胺环的化学本质：

• 青霉素之所以能杀菌，是因为其结构中有一个四元环（$\beta$-内酰胺环）。这个环的张力很大，极不稳定，像一个随时准备弹开的捕兽夹。当它遇到细菌的转肽酶，这个环会“啪”地弹开，通过共价键死死卡住酶的活性中心（不可逆抑制）。
• 正因为张力大，它也很容易被酸、碱或温度破坏（水解）。这就是为什么在分子克隆中，倒平板时要求温度不能太高（$< \pu{55 ^{\circ}C}$），否则抗生素还没用就先热分解了；也是为什么做蓝白斑筛选时，要把平板倒置（防止冷凝水滴落溶解并稀释局部的抗生素）。

发酵工程的深层原理

生物学原理：代谢流（Metabolic Flux）

• 中心法则：DNA $\to$ RNA $\to$ 蛋白质。发酵工程本质上是操纵这个流程。

• 代谢调控：微生物很聪明，当环境中有容易吃的葡萄糖时，它们会关闭分解难吃食物的基因（葡萄糖效应）。发酵工程师需要欺骗或解除这种调节。

• 反馈抑制：产物多了，合成酶就停止工作。工程师通过基因突变解除这种“刹车”。

• ATP 平衡：细胞活着需要能量，合成产物也需要能量。发酵工艺必须在“细胞长肉”和“细胞干活（产物）”之间找到能量分配的平衡点。

化学工程原理：传递过程（Transport Phenomena）

发酵罐不是一个简单的桶，而是一个反应器。

• 供氧（$K_La$）：这是好氧发酵最大的瓶颈。氧气难溶于水。必须通过搅拌桨打碎气泡，增加气液接触面积。$K_La$（体积氧传递系数） 是衡量发酵罐性能的最重要参数。

• 流变学：霉菌发酵时，菌丝会缠绕，发酵液变得像浆糊一样稠，导致混合困难，热量散不出去，很容易把菌“烧死”。

动力学原理（Kinetics）：莫诺方程（Monod Equation） 描述微生物生长速率与底物浓度关系的数学模型：

这是计算机控制发酵过程的基石。工程师通过计算，决定什么时候补糖，补多少糖，什么时候停止发酵。

发酵技术的历史演变对比：

未来趋势：合成生物学：合成生物学（Synthetic Biology） 正在重新定义发酵。我们不再只是利用现有的微生物，而是像编程一样编写 DNA 代码，从头设计细胞工厂，甚至实现“无细胞发酵系统”。发酵正在成为制造万物（从塑料替代品到人造牛奶）的通用平台。