细胞的生命历程

细胞分裂

细胞分裂的分类

减数分裂的过程

细胞工程

细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。

生物技术是应用生命科学的研究成果，对生物或生物的成分、产物等进行改造和利用的技术。生物技术是一个综合性的技术体系，我们可以将它与工程学原理相结合，来进行研究、设计和加工生产，为社会提供服务。

植物细胞工程

细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能，即细胞具有全能性。但是，在生物的生长发育过程中，并不是所有的细胞都表现出全能性，比如，芽原基的细胞只能发育为芽，叶原基的细胞只能发育为叶。这是因为在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达。植物组织培养是指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。这些离体培养的植物器官、组织或细胞被称为外植体。

植物细胞一般具有全能性。在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞可以经过脱分化，即失去其特有的结构和功能，转变成未分化的细胞，进而形成不定形的薄壁组织团块，这称为愈伤组织。愈伤组织能重新分化成芽、根等器官，该过程称为再分化。植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向。将愈伤组织接种到含有特定激素的培养基上，就可以诱导其再分化成胚状体，长出芽和根，进而发育成完整的植株。

植物细胞外面有一层细胞壁，这层细胞壁阻碍着细胞间的杂交。因此，在进行体细胞杂交之前，必须先利用纤维素酶和果胶酶去除这层细胞壁，获得原生质体。杂交过程中的一个关键环节，是原生质体间的融合，这必须要借助一定的技术手段才能实现。人工诱导原生质体融合的方法基本可以分为两大类—物理法和化学法。物理法包括电融合法、离心法等；化学法包括聚乙二醇（PEG）融合法、高 $\ce{Ca^2+}$—高 $\pH$ 融合法等。融合后得到的杂种细胞再经过诱导可形成愈伤组织，并可进一步发育成完整的杂种植株。

植物体细胞杂交是指将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。利用这项技术，科学家培育出了白菜—甘蓝、普通小麦—长穗偃麦草等杂种植株。植物体细胞杂交技术在打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种等方面展示出独特的优势。

植物细胞工程在农业、医药工业等方面有着广泛的应用，并且取得了显著的社会效益和经济效益。

• 快速繁殖：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术，被人们形象地称为植物的快速繁殖技术，也叫作微型繁殖技术。它不仅可以高效、快速地实现种苗的大量繁殖，还可以保持优良品种的遗传特性。

• 作物脱毒：20 世纪 50 年代，科学家就发现植物顶端分生区附近（如茎尖）的病毒极少，甚至无病毒。因此，切取一定大小的茎尖进行组织培养，再生的植株就有可能不带病毒，从而获得脱毒苗。

• 单倍体育种：常规选育出一个可以稳定遗传的作物优良品种，一般要经过 $5 \sim 6$ 年的连续筛选。而单倍体育种可以先通过花药（或花粉）培养获得单倍体植株，然后经过诱导染色体加倍，当年就能培育出遗传性状相对稳定的纯合二倍体植株，这极大地缩短了育种的年限，节约了大量的人力和物力。单倍体育种已成为作物育种的一条有效途径。此外，由于大多数单倍体植株的细胞中只含有一套染色体，染色体加倍后得到的植株的隐性性状容易显现，因此它也是进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料。

• 突变体的利用：在植物的组织培养过程中，由于培养细胞一直处于不断增殖的状态，因此它们容易受到培养条件和诱变因素（如射线、化学物质等）的影响而产生突变。从产生突变的个体中可以筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。

初生代谢是生物生长和生存所必需的代谢活动，因此在整个生命过程中它一直进行着。初生代谢物有糖类、脂质、蛋白质和核酸等。次生代谢不是生物生长所必需的，一般在特定的组织或器官中，并在一定的环境和时间条件下才进行。植物代谢会产生一些一般认为不是植物基本的生命活动所必需的产物—次生代谢物。次生代谢物是一类小分子有机化合物（如酚类、萜类和含氮化合物等），在植物抗病、抗虫等方面发挥作用，也是很多药物、香料和色素等的重要来源。

由于植物细胞的次生代谢物含量很低，从植物组织提取会大量破坏植物资源，有些产物又不能或难以通过化学合成途径得到，因此人们期望利用植物细胞培养来获得目标产物，这个过程就是细胞产物的工厂化生产。植物细胞培养是指在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖的技术。它不占用耕地，几乎不受季节、天气等的限制，因此对于社会、经济、环境保护具有重要意义。

动物细胞工程

动物细胞工程常用的技术包括动物细胞培养、动物细胞融合和动物细胞核移植等，其中动物细胞培养是动物细胞工程的基础。人造皮肤的构建、动物分泌蛋白的规模化生产等，都离不开动物细胞培养。动物细胞培养是指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。我们知道，动物体内的细胞之所以能够维持正常的生命活动，有些细胞还能不断增殖，是因为机体给这些细胞提供了适宜的条件，包括充足的营养、稳定的内环境等。在体外培养动物细胞，也需要满足类似的条件。

• 营养：细胞在体外培养时，培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质。将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分。培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。

• 无菌、无毒的环境：在体外培养细胞时，必须保证环境是无菌、无毒的，即需要对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作。培养液还需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。

• 温度、$\pH$ 和渗透压：维持细胞生存必须有适宜的温度。哺乳动物细胞培养的温度多以 $\pu{36.5 \pm 0.5 ^oC}$ 为宜。多数动物细胞生存的适宜 $\pH$ 为 $7.2 \sim 7.4$。此外，渗透压也是动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要环境参数。

• 气体环境：动物细胞培养所需气体主要有 $\ce{O2}$ 和 $\ce{CO2}$。$\ce{O2}$ 是细胞代谢所必需的，$\ce{CO2}$ 的主要作用是维持培养液的 $\pH$。在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有 $95\%$ 空气和 $5\%$ 的 $\ce{CO2}$ 混合气体的 $\ce{CO2}$ 培养箱中进行培养。

在从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖。因此，在进行细胞培养时，首先要对新鲜取材的动物组织进行处理，或用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间，将组织分散成单个细胞。然后，用培养液将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液放入培养瓶或培养皿内，置于适宜环境中培养。体外培养的动物细胞可以分为两大类：一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖；另一类则需要贴附于某些基质表面才能生长增殖，大多数细胞属于这种类型，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素的影响外，还会发生接触抑制现象，即当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。这时就需要对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖。人们通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养，将分瓶后的细胞培养称为传代培养。在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。

干细胞和 iPS 细胞

干细胞的培养成功是动物细胞培养领域重大的成就之一，在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。干细胞存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中，包括胚胎干细胞和成体干细胞等。

胚胎干细胞（简称 ES 细胞）存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能，ES 细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等细胞。成体干细胞是成体组织或器官内的干细胞，包括骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞和睾丸中的精原干细胞等。一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。造血干细胞是发现最早、研究最多、应用也最为成熟的一类成体干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中。

有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有着广泛的应用。例如，将正常的造血干细胞移植到病人体内，恢复病人的造血和免疫功能，已成为治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病的一种重要手段；神经干细胞在治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）方面有重要的应用价值。

胚胎干细胞必须从胚胎中获取，这涉及伦理问题，因而限制了它在医学上的应用。2006 年，科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，将它称为诱导多能干细胞（简称 iPS 细胞），并用 iPS 细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。现在，用 iPS 细胞治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。因为诱导过程无须破坏胚胎，而且 iPS 细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应，所以科学家普遍认为 iPS 细胞的应用前景优于胚胎干细胞。

科学家已尝试采用多种方法来制备 iPS 细胞，包括借助载体将特定基因导入细胞中，直接将特定蛋白导入细胞中或者用小分子化合物等来诱导形成 iPS 细胞。iPS 细胞最初是由成纤维细胞转化而来的，后来发现已分化的 T 细胞、B 细胞等也能被诱导为 iPS 细胞。干细胞的研究正在如火如荼地开展。虽然将干细胞用于临床治疗还面临一些问题，如存在导致肿瘤发生的风险，但是我们相信，随着理论和技术的不断完善，干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。

动物细胞融合技术

动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同。诱导动物细胞融合的常用方法有 PEG 融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。灭活病毒诱导细胞融合的原理是：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。人们可以按照预先的设计使不同细胞融合，至今，种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得了成功。目前，这一技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段，特别是利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。

早期人们为了获得抗体，就向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。用这种方法制备的抗体不仅产量低、纯度低，而且特异性差。为了解决这一难题，科学家进行了多年的研究和探索。他们发现，哺乳动物感染病原体后，体内会形成相应的 B 淋巴细胞，这些细胞能分泌抗体，抗体识别并特异性结合病原体，从而抑制病原体的增殖等。动物体内产生的特异性抗体的种类超过百万种，但每一个 B 淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。因此，要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的 B 淋巴细胞，形成细胞群。1975 年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒在前人工作的基础上，充分发挥想象力，设计了一个极富创造性的实验方案。他们想到，如果把一种 B 淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞融合，所得到的融合细胞就可能大量增殖，产生足够数量的特定抗体。根据该设想，通过实验，他们得到了单克隆抗体。

1. 用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的 B 淋巴细胞。

2. 用特定的选择培养基进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。

3. 对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。

4. 将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。

5. 从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。

使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体—药物偶联物通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC 通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。

单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备，因此被广泛用作诊断试剂，在多种疾病的诊断和病原体鉴定中发挥重要的作用。例如，利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。除前面介绍的单克隆抗体可以运载药物外，单克隆抗体自身也能用于治疗疾病。在医药领域，单克隆抗体药物占有非常重要的地位。

细胞核移植技术

动物细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。由于动物胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易，而动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难，因此动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。而在动物体细胞核移植中，非人灵长类动物的体细胞核移植非常困难。主要原因一方面是供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态，这导致了胚胎发育率低；另一方面是对非人灵长类动物胚胎进行操作的技术尚不完善。

体细胞核移植技术在畜牧业、医药卫生以及其他领域有着广泛的应用前景。在畜牧生产中，利用体细胞核移植技术，可以加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育。在医药卫生领域，通过建立转基因体细胞系，再利用体细胞核移植技术培育的转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产许多珍贵的医用蛋白；在治疗人类疾病时，转基因克隆动物的细胞、组织或器官可以用于异种移植；以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞，经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官，将它们移植给患者时可以避免发生免疫排斥反应。此外，研究克隆动物可使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程；克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因；克隆特定疾病模型的动物，还能为研究该疾病的致病机制和开发相应的药物提供帮助。在保护濒危物种方面，该技术有望增加濒危物种的存活数量。

尽管通过体细胞核移植技术已经获得了多种克隆动物，但该技术的成功率仍然非常低，各个技术环节也有待进一步改进。相对于技术研究，核移植的理论研究较为滞后，需要与发育生物学、细胞生物学和分子遗传学等学科更深层次的理论研究相结合。此外，一些研究者指出，绝大多数克隆动物存在健康问题，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体形过大、异常肥胖、发育困难、脏器缺陷和免疫失调等。总之，体细胞核移植技术的研究仍在继续深入，人类对克隆技术的应用还有许多问题需要解决。期待在不远的将来，克隆技术能更好地造福于人类。

胚胎工程的理论基础

胚胎工程的迅猛发展让人们大量繁殖优良家畜品种的愿望，正在成为现实。胚胎工程是指对生殖细胞、受精卵或早期胚胎细胞进行多种显微操作和处理，然后将获得的胚胎移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。胚胎工程技术包括体外受精、胚胎移植和胚胎分割等。胚胎工程的许多技术，实际上是在体外条件下，对动物自然受精和早期胚胎发育条件进行的模拟操作。因此，了解哺乳动物受精和早期胚胎发育的规律十分重要。

受精是精子与卵子结合形成合子（即受精卵）的过程，包括受精前的准备阶段和受精阶段。在自然条件下，哺乳动物的受精在输卵管内完成。

• 精子获能：科学研究发现，刚刚排出的精子不能立即与卵子受精，必须在雌性动物的生殖道发生相应的生理变化后，才能获得受精能力，这一生理现象称为“精子获能”。通过对精子获能机制的研究，科学家找到了使精子在体外获能的方法，实现了各种哺乳动物精子在体外条件下的获能，为体外受精技术的建立奠定了重要基础。使精子获能的方法有直接利用雌性动物的生殖道使精子获能；将精子培养在人工配制的获能液中使其获能等。获能液的成分因动物种类不同而有所差异，常见的有效成分有肝素、$\ce{Ca^2+}$ 载体等。

• 卵子的准备：卵子一般在排出 $\pu{2 \sim 3 h}$ 后才能被精子穿入。动物排出的卵子成熟程度不同，有的可能是初级卵母细胞，如马、犬等；有的可能是次级卵母细胞，如猪、羊等。但它们都要在输卵管内进一步成熟，到 $M_{\text{II}}$ 期时，才具备与精子受精的能力。

• 受精阶段：获能后的精子与卵子相遇时，首先它释放出多种酶，以溶解卵细胞膜外的一些结构，同时借助自身的运动接触卵细胞膜。随之，精子的细胞膜与卵细胞膜融合，卵细胞膜外的透明带迅速发生生理反应，阻止后来的精子进入透明带。精子入卵后，卵细胞膜也会立即发生生理反应，拒绝其他精子再进入卵内。精子入卵后，尾部脱离，原有的核膜破裂并形成一个新的核膜，最后形成一个比原来精子的核还大的核，叫作雄原核。与此同时，精子入卵后被激活的卵子完成减数分裂Ⅱ，排出第二极体后，形成雌原核。雄、雌原核充分发育后，相向移动，彼此靠近，核膜消失。这个含有两个染色体组的合子就是受精卵。受精过程结束后，受精卵的发育也就开始了。

多数哺乳动物的第一极体不进行减数分裂Ⅱ，因而不会形成两个第二极体。在实际胚胎工程操作中，常以观察到两个极体或者雌、雄原核作为受精的标志。受精卵形成后即在输卵管内进行有丝分裂，开始发育。胚胎发育早期，有一段时间是在透明带内进行分裂，细胞的数量不断增加，但胚胎的总体积并不增加，这种受精卵的早期分裂称为卵裂。根据胚胎形态的变化，可将早期发育的胚胎分为以下几个阶段。

• 桑葚胚：当卵裂产生的子细胞逐渐形成致密的细胞团，形似桑葚时，这时的胚胎称为桑葚胚。

• 囊胚：胚胎进一步发育，细胞继续分化。聚集在胚胎一端的细胞形成内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织；而沿透明带内壁扩展和排列的细胞，称为滋养层细胞，它们将来发育成胎膜和胎盘。

随着胚胎的进一步发育，胚胎的内部出现了含有液体的腔—囊胚腔，这个时期的胚胎叫作囊胚。囊胚进一步扩大，透明带破裂，胚胎从其中伸展出来，这一过程叫作孵化。孵化非常重要，如果不能正常孵化，胚胎就无法继续发育。囊胚孵化后，将发育形成原肠胚。原肠胚表面的细胞层为外胚层，向内迁移的细胞形成内胚层。随着发育的进行，一部分细胞还会在内、外两个胚层之间形成中胚层。这三个胚层将逐渐分化形成各种组织、器官等。

胚胎工程技术及其应用

胚胎工程技术包含的内容很丰富，目前在医学和生产上应用较多的是体外受精、胚胎移植和胚胎分割等，借助这些技术，可以进一步挖掘动物的繁殖潜力。

通过人工操作使卵子在体外受精，经培养发育为早期胚胎后，再进行移植产生的个体。体外受精技术是提高动物繁殖能力的有效措施，还可以为胚胎移植提供可用的胚胎。在这个过程中，首先要做的就是体外受精。哺乳动物的体外受精技术主要包括卵母细胞的采集、精子的获取和受精等步骤。采集到的卵母细胞和精子，要分别在体外进行成熟培养和获能处理，然后才能用于体外受精。一般情况下，可以将获能的精子和培养成熟的卵子置于适当的培养液中共同培养一段时间，来促使它们完成受精。

胚胎移植是指将通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”，接受胚胎的个体叫“受体”。通过任何一项技术（如转基因、核移植和体外受精等）获得的胚胎，都必须移植给受体才能获得后代。以牛的胚胎移植为例，胚胎移植主要包括供体、受体的选择和处理，配种或人工授精，胚胎的收集、检查、培养或保存，胚胎的移植，以及移植后的检查等步骤。

进行胚胎移植的优势是可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。在这项技术中，供体的主要职能变为产生具有优良遗传特性的胚胎，繁重而漫长的妊娠和育仔任务由受体取代，这就大大缩短了供体本身的繁殖周期。同时，在对供体施行超数排卵处理后，可获得多枚胚胎，经移植可得到多个后代，这使供体的后代数是自然繁殖的十几倍到几十倍。超数排卵是指应用外源促性腺激素，诱发卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子。

胚胎分割：早期胚胎细胞具有很强的分裂能力，并保持着细胞全能性，能不能将一个胚胎分割成几份，从而提高胚胎的利用率？基于这样的设想，胚胎分割技术逐渐发展成熟。胚胎分割是指采用机械方法将早期胚胎切割成 2 等份、4 等份或 8 等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，因此胚胎分割可以看作动物无性繁殖或克隆的方法之一。胚胎分割所需要的主要仪器设备为体视显微镜和显微操作仪。在进行胚胎分割时，应选择发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚，将它移入盛有操作液的培养皿中，然后在显微镜下用分割针或分割刀分割。在分割囊胚阶段的胚胎时，要注意将内细胞团均等分割。对于不同发育阶段的胚胎，分割的具体操作不完全相同。分割后的胚胎可以直接移植给受体，或经体外培养后，再移植给受体。经过 40 多年的发展，胚胎分割技术日趋成熟。这项技术可以促进优良动物品种的繁殖，产生的遗传性状相同的后代是进行遗传学研究的宝贵材料。此外，在胚胎移植前，进行性别鉴定、遗传病筛查等，对于人工控制动物性别、动物繁育健康后代具有重要意义。

1978 年，科学家将小鼠的桑葚胚一分为二，获得了成功。1979 年，科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊。20 世纪 80 年代后，人们建立了系统的胚胎分割方法，并相继得到 ¼ 和 ⅛ 分割胚胎的后代。我国的胚胎工程专家也进行了分割胚胎移植的实验研究，成功地对小鼠、家兔、绵羊、山羊和牛等动物进行了分割胚胎移植，并将二分胚胎分割技术应用到牛和羊的胚胎移植中。尽管胚胎分割技术已经在多种动物中取得成功，但仍存在一些问题，如刚出生的动物体重偏低，毛色和斑纹可能存在差异等。实践证明，采用胚胎分割技术产生同卵多胚的可能性是有限的，分割次数越多，分割后胚胎成活的概率越小。目前，仍然以二分胚胎的分割和移植效率最高，这成为提高家畜胚胎利用率的手段之一。

基因工程概述

基因工程的诞生和发展

基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的，正是这些学科的基础理论和相关技术的发展催生了基因工程。基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在 DNA 分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组 DNA 技术。

• 1944 年，艾弗里（O. Avery， $1877 \sim 1955$）等通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是 DNA，还证明了 DNA 可以在同种生物的不同个体之间转移。

• 1950 年，埃德曼（P. Edman， $1916 \sim 1977$）发明了一种测定氨基酸序列的方法。2 年后，桑格（F. Sanger， $1918 \sim 2013$）首次完成了对胰岛素氨基酸序列的测定。

• 1953 年，沃森（J. D. Watson， $1928 \sim$）和克里克（F. Crick， $1916 \sim 2004$）建立了 DNA 双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。

• 1958 年，梅塞尔森（M. Meselson， $1930 \sim$）和斯塔尔（F. W. Stahl， $1929 \sim$）用实验证明了 DNA 的半保留复制。几乎同一时期确立的中心法则阐明了遗传信息流动的方向。

• 1961 年，尼伦伯格（M. W. Nirenberg， $1927 \sim 2010$）和马太（J. H. Matthaei， $1929 \sim$）破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至 1966 年，64 个密码子均被成功破译。

• 1967 年，科学家发现，在细菌拟核 DNA 之外的质粒具有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。

• 1970 年，科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。

• 20 世纪 70 年代初，多种限制酶、DNA 连接酶和逆转录酶相继被发现。这些发现为 DNA 的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。

• 1972 年，伯格（P. Berg， $1926 \sim 2023$）首先在体外进行了 DNA 改造的研究，成功地构建了第一个体外重组 DNA 分子。

• 1973 年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组 DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。

• 1977 年，桑格等科学家发明了 DNA 序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能。此后，DNA 合成的问世为体外合成 DNA 提供了方便。

• 1982 年，第一个基因工程药物——重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。

• 1983 年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。

• 1984 年，我国科学家朱作言（$1941 \sim$）领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。

• 1985 年，穆里斯（K. Mullis， $1944 \sim 2019$）等人发明了 PCR，为获取目的基因提供了有效手段。

• 1990 年，人类基因组计划启动。2003 年，该计划的测序任务顺利完成。

• 2013 年，华人科学家张锋（$1982 \sim$）及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术——CRISPR（成簇规律间隔短回文重复）技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。

• 21 世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。

上述仅是按照时间顺序简要提及基因工程相关基础理论的突破和技术的创新。有些你已经学习过，更多的将在本章中展开。科学提供对世界的说明，技术将科学原理应用于认识自然、造福人类的实践，工程则综合运用多种技术来生产人类需要的产品。科学、技术、工程和社会的互动，不断调整着人类与自然界的关系，推动着文明的进步。

重组 DNA 技术的基本工具

实现这一精确的操作过程至少需要三种分子工具，即准确切割 DNA 分子的分子手术刀、将 DNA 片段再连接起来的分子缝合针和将体外重组好的 DNA 分子导入受体细胞的分子运输车。

• 限制性内切核酸酶：切割 DNA 分子的工具是限制性内切核酸酶，简称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。迄今分离的限制酶有数千种，许多已经被商业化生产。它们能够识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。

  

  大多数限制酶的识别序列由 $6$ 个核苷酸组成。例如，EcoRⅠ、SmaⅠ限制酶的识别序列均为 $6$ 个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由 $4$ 个、$8$ 个或其他数量的核苷酸组成。DNA 分子经限制酶切割产生的 DNA 片段末端通常有 两种形式（黏性末端和平末端）。当限制酶在它识别序列的中心轴线（图中虚线）两侧将 DNA 分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。

• DNA 连接酶：将切下来的 DNA 片段拼接成新的 DNA 分子，是靠 DNA 连接酶来完成的。1967 年，世界上几个实验室几乎 同时发现了一种能够将两个 DNA 片段连接起来的酶，称之 为 DNA 连接酶（DNA ligase）。在基因工程操作中，DNA 连接酶主要有两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称 为 E.coli DNA 连接酶；另一类是从 T4 噬菌体中分离出来 的，称为 T4 DNA 连接酶。这两类酶都能将双链 DNA 片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，但 E.coli DNA 连接酶连接具有平末端的 DNA 片段的效率要远远低 于 T4 DNA 连接酶。

• 分子运输车：怎样才能将外源基因送入细胞呢？通常是利用质粒（plasmid）作为载体（vector），将基因送入细胞。质粒是一种 裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核 DNA 之外，并具有自我复制能力的环状双链 DNA 分子。质 粒 DNA 分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源 DNA 片段（基因）插入其中。携带外源 DNA 片段的质粒进入受体 细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体 DNA 上，随受体 DNA 同步复制。在基因工程操作中，真正被用作载 体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。这 些质粒上常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄 青霉素抗性基因等，便于重组 DNA 分子的筛选（图 3-4）。

  

  在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式 以及可以插入外源 DNA 片段的大小上也有很大差别。这些 基因工程载体，相当于一种运输工具，因此将它们比喻为“分子运输车”。

DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如，DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离 DNA 与蛋白质。DNA 在不同浓度的 $\ce{NaCl}$ 溶液中溶解度不同，它能溶于 $\pu{2 mol/L}$ 的 $\ce{NaCl}$ 溶液。在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定 DNA 的试剂。

DNA 片段的扩增及电泳鉴定

利用 PCR 可以在体外进行 DNA 片段的扩增。PCR 利用了 DNA 的热变性原理，通过调节温度来控制 DNA 双链的解聚与结合。PCR 仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次 PCR 一般要经历 30 次循环。

DNA 分子具有可解离的基团，在一定 $\pH$ 下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中 DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象等有关。凝胶中的 DNA 分子通过染色，可以在波长为 $\pu{300 nm}$ 的紫外灯下被检测出来。

1. 用微量移液器按照右栏中的配方或 PCR 试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。

2. 待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约 $10 \pu{s}$，使反应液集中在管的底部。

3. 参照下表的参数，设置好 PCR 仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入 PCR 仪中进行反应。

4. 根据待分离 DNA 片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为 $0.8\% \sim 1.2\%$ 的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。

5. 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。

6. 待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。

7. 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶 $\pu{1 mm}$ 为宜。

8. 将扩增得到的 PCR 产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。

9. 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为 $1 \sim 5 \pu{V / cm}$。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。

10. 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。

注意

1. 为避免外源 DNA 等因素的污染，PCR 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。

2. 该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在 $\pu{-20 ^oC}$ 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。

3. 在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。

基因工程的应用

基因工程自 20 世纪 70 年代兴起后，得到了飞速的发展，在农牧业、医药卫生和食品工业等方面，展示出广阔的应用前景。

基因工程在农牧业方面的应用

基因工程在农牧业中的应用发展迅速。$1996 \sim 2017$ 年，全世界转基因作物的种植面积增加了一百多倍，从 $1.7 \times 10^6 \pu{hm^2}$ 发展到 $1.898 \times 10^8 \pu{hm^2}$（图 3-9）。2016 年世界范围的统计数据表明，转基因作物的种植使化学杀虫剂施用量减少了 $8.2\%$，作物产量增加了 $6.6 \times 10^8 \pu{t}$，增加经济收益近 1.3 万亿元。美国是世界上转基因作物种植面积最大的国家，转基因棉花、大豆、玉米的种植面积占相关作物种植面积的比例都超过了 $90\%$。2017 年，我国转基因作物的种植面积位居世界第八位，商业化种植的转基因作物有棉花和番木瓜。

在转基因动物方面，近些年几乎每年都有令人瞩目的研究成果报道，有些成果正在进入实用化和商业化开发的阶段。2015 年 11 月，第一种用于食用的转基因动物——转基因大西洋鲑（俗称“三文鱼”）在美国获得批准上市。

目前，基因工程技术已被广泛用于改良动植物品种、提高作物和畜产品的产量等方面。

• 转基因抗虫植物：从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将它导入作物中培育出具有抗虫性的作物，是目前防治作物虫害的一种发展趋势。已问世的转基因抗虫植物有转基因抗虫棉花、玉米、大豆、水稻（图 3-10）和马铃薯等。

• 转基因抗病植物：许多栽培作物由于自身缺少抗病基因，因此用常规育种的方法很难培育出抗病的新品种。科学家将来源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物中，培育出了转基因抗病植物，如转基因抗病毒甜椒（图 3-11）、番木瓜和烟草等。

• 转基因抗除草剂植物：杂草常常危害农业生产，而大多数除草剂不仅能杀死田间杂草，还会损伤作物，导致作物减产。将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可以培育出抗除草剂的作物品种。这样在喷洒除草剂时，田间杂草会被杀死而作物不会受到损伤。目前已经获得转基因抗除草剂玉米（图 3-12）、大豆（图 3-13）、油菜和甜菜等。

• 改良植物的品质：随着生活水平的提高，人们越来越关注植物的营养价值、观赏价值等，利用转基因技术可以改良这些品质。例如，将某种必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，可以提高这种氨基酸的含量，科学家培育的某种转基因玉米中赖氨酸的含量比对照高 $30\%$。我国科学家成功地将与植物花青素代谢相关的基因导入矮牵牛中，使它呈现出自然界没有的颜色变异，大大提高了它的观赏价值（图 3-14）。

• 提高动物的生长速率：由于外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长得更快，因此科学家将这类基因导入动物体内，以提高动物的生长速率。例如，我国科学家将外源生长激素基因导入鲤鱼，在同等养殖条件下，转基因鲤鱼的生长速率比非转基因鲤鱼提高了 $42\% \sim 115\%$（图 3-15）。

• 改善畜产品的品质：有些人由于乳糖酶分泌少，不能完全消化牛奶中的乳糖，食用牛奶后会出现腹泻等不适症状，这称为乳糖不耐受。我国约有 $1/3$ 的成年人对乳糖不耐受。为了解决这一问题，科学家将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响。

基因工程在医药卫生领域的应用

对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们能够生产药物，是目前基因工程取得实际应用成果非常多的领域。这些药物包括细胞因子、抗体、疫苗和激素等，它们可以用来预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、传染病、糖尿病和类风湿关节炎等。我国生产的重组人干扰素、血小板生成素、促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等基因工程药物均已投放市场（图 3-16）。

干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。此外，干扰素对治疗乳腺癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和某些白血病等也有一定的疗效。传统生产干扰素的方法是从人血液中的白细胞内提取，每 $\pu{300 L}$ 血液只能提取出 $\pu{1 mg}$ 干扰素。$1980 \sim 1982$ 年，科学家用基因工程方法从大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素，从 $\pu{1 kg}$ 培养物中可以得到 $\pu{20 \sim 40 mg}$ 干扰素。1993 年，我国批准生产重组人干扰素 $\alpha$-1b，它是我国批准生产的第一个基因工程药物，目前主要用于治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎等。

利用基因工程技术，还可以让哺乳动物批量生产药物。科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。目前，科学家已经在牛、山羊等动物乳腺生物反应器中，获得了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和 $\alpha$-抗胰蛋白酶等重要的医药产品。

基因工程技术还可能使建立移植器官工厂的设想成为现实。目前，人体移植器官短缺是一个世界性难题。为此，人们不得不把目光移向寻求可替代的移植器官。由于猪的内脏构造、大小、血管分布与人的极为相似，而且与灵长类动物相比，猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒要少得多，是否可以用猪的器官来解决人类器官移植的来源问题呢？实现这一目标的最大难题是免疫排斥。目前，科学家正尝试利用基因工程技术改造猪的器官，采用的方法是在器官供体的基因组中导入调控基因表达的 DNA 序列，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。

基因工程在食品工业方面的应用

利用基因工程菌除了可以生产药物，还能生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。例如，阿斯巴甜是一种普遍使用的甜味剂，主要由天冬氨酸和苯丙氨酸形成，这两种氨基酸就可以通过基因工程实现大规模生产。

奶酪是一种被广泛食用的发酵奶制品。大多数奶酪的生产需要使用凝乳酶来凝聚固化奶中的蛋白质。传统的制备凝乳酶的方法是通过杀死未断奶的小牛，然后将它的第四胃的黏膜取出来进行提取。随着人口的增长和人们饮食需求的变化，单纯依靠宰杀小牛来获得凝乳酶的方法已不能满足日益增长的市场需求。于是，科学家将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。用这种方法生产的凝乳酶已于 1990 年投入市场，截至 2016 年，有超过 17 个国家在用它生产奶酪。

加工转化糖浆需要的淀粉酶，加工烘烤食品要用到的脂肪酶等也都可以通过构建基因工程菌，然后用发酵技术大量生产。相比从天然产物中提取的酶，用基因工程技术获得的工业用酶的纯度更高，而且它的生产成本显著降低，生产效率较高。

基因工程使人们更容易培育出具有优良性状的动植物品种，获得很多过去难以得到的生物制品，甚至还能培育出可以降解多种污染物的“超级细菌”来处理环境污染，利用经过基因改造的微生物来生产能源…… 未来，期待基因工程带给我们更多的惊喜。

蛋白质工程的原理和应用

对蛋白质分子的设计和改造是通过蛋白质工程来实现的。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。它是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是涉及多学科的综合科技工程。

随着分子生物学、晶体学以及计算机技术的迅猛发展，蛋白质工程取得了很大的进展。目前，它已成为研究蛋白质结构和功能的重要手段，并将广泛应用于农业、医药工业和其他工业生产中。

为什么要进行蛋白质工程的研究呢？我们知道，将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状，这就是基因工程的实质。基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。例如，玉米中赖氨酸的含量比较低，原因是赖氨酸合成过程中的两种关键酶——天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性，受细胞内赖氨酸浓度的影响较大。赖氨酸达到一定浓度就会抑制这两种酶的活性，所以赖氨酸含量很难提高。如果我们将天冬氨酸激酶中第 352 位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶中第 104 位的天冬酰胺变成异亮氨酸，就可以使玉米叶片和种子中游离赖氨酸的含量分别提高 5 倍和 2 倍。

蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。

我们知道，天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的：

而蛋白质工程却与之相反，它的基本思路是：

（图 3-17）

蛋白质工程经常要借助计算机来建立蛋白质的三维结构模型；要制备蛋白质晶体，然后通过 X 射线衍射技术，分析晶体的结构；要用到基因的定点突变技术来进行碱基的替换。

蛋白质工程的应用

蛋白质工程取得的进展向人们展示出诱人的前景。研发速效胰岛素类似物就是生动的实例。天然胰岛素制剂容易形成二聚体或六聚体，皮下注射胰岛素后往往要经历一个逐渐解离为单体的过程，这在一定程度上延缓了疗效。因此，科学家希望对胰岛素进行改造，从而降低它的聚合作用。研究人员通过解析人胰岛素的晶体结构发现，人胰岛素由 A 链和 B 链构成，其中 B 链的第 $20 \sim 29$ 位氨基酸是胰岛素分子相互作用形成多聚体的关键区域，改变这个区域氨基酸的组成就有可能降低胰岛素分子间的作用力。目前，科学家已通过改造胰岛素基因实现了对相应氨基酸序列的改造，使 B28 位脯氨酸替换为天冬氨酸或者将它与 B29 位的赖氨酸交换位置，从而有效抑制了胰岛素的聚合，由此研发出的速效胰岛素类似物产品已经在临床上广泛应用。

在医药工业方面，利用蛋白质工程研发药物并不少见。例如，如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，在一定条件下，可以延长保存时间；小鼠单克隆抗体会使人产生免疫反应，从而导致它的治疗效果大大降低，科学家将小鼠抗体上结合抗原的区域“嫁接”到人的抗体上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会降低很多。在其他工业方面，蛋白质工程被广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶。例如，枯草杆菌蛋白酶具有水解蛋白质的作用，因此常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。迄今为止，利用蛋白质工程获得的该酶的突变体已有上百种，从中可能筛选出一些符合工业化生产需求的突变体，从而提高这种酶的使用价值。在农业方面，科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量；还有科学家利用蛋白质工程的思路来设计优良微生物农药，通过改造微生物蛋白质的结构，使它防治病虫害的效果增强。

蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂（图 3-18）。科学家要设计出更加符合人类需要的蛋白质，还需要不断地攻坚克难。我们相信，随着科学技术的深入发展，蛋白质工程将会给人类带来更多的福祉。

基因工程的基本操作程序

培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。

第一步：目的基因的筛选与获取

在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。

苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家通过实验，将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生 Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。这个“杀虫基因”就是培育转基因抗虫棉用到的目的基因——Bt 抗虫蛋白基因，简称 Bt 基因。

筛选合适的目的基因

在浩瀚的“基因海洋”中找到所需要的目的基因往往不容易，从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。在培育转基因抗虫棉之前，用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。研究表明，苏云金杆菌的杀虫作用与 Bt 基因有关。科学家不仅掌握了 Bt 基因的序列信息，也对 Bt 基因的表达产物——Bt 抗虫蛋白有了较为深入的了解。因此，Bt 基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。

随着测序技术的发展，以及序列数据库（如 GenBank）、序列比对工具（如 BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这也为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。

当 Bt 抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt 抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此，Bt 抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。

利用 PCR 获取和扩增目的基因

获取目的基因的方法有多种。在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家人工合成了目的基因。现在，常用 PCR 特异性地快速扩增目的基因。

PCR 是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据 DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与 DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术（表 3-1）。该技术由穆里斯等人于 1985 年发明，为此，穆里斯于 1993 年获得了诺贝尔化学奖。

表 3-1 DNA 复制所需的基本条件

PCR 反应需要在一定的缓冲液中才能进行，需提供 DNA 模板，分别与两条模板链结合的 2 种引物，4 种脱氧核苷酸和耐高温的 DNA 聚合酶；同时通过控制温度使 DNA 复制在体外反复进行。扩增的过程是：目的基因 DNA 受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链 DNA 为模板，在 DNA 聚合酶作用下进行延伸，即将 4 种脱氧核苷酸加到引物的 $3'$ 端，如此重复循环多次。由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为 $2^n$，其中 $n$ 为扩增循环的次数）。每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步（图 3-5）。

1. 变性 当温度超过 90 ℃时，双链 DNA 解聚为单链。

2. 复性 当温度下降到 50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合。

3. 延伸 当温度上升到 72 ℃左右时，溶液中的 4 种脱氧核苷酸在耐高温的 DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的 DNA 链。

第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物。上述过程可以在 PCR 扩增仪（PCR 仪）中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定 PCR 的产物。

真核细胞和细菌的 DNA 聚合酶都需要 $\ce{Mg^2+}$ 激活。因此，PCR 反应缓冲液中一般要添加 $\ce{Mg^2+}$。引物是一小段能与 DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于 PCR 的引物长度通常为 $20 \sim 30$ 个核苷酸。

第二步：基因表达载体的构建

获取了足够量的 Bt 基因后，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使 Bt 基因能够表达和发挥作用，这就需要构建基因表达载体。这一步是培育转基因抗虫棉的核心工作。

基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，它还必须有启动子（promoter）、终止子（terminator）等。启动子是一段有特殊序列结构的 DNA 片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出 mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的 DNA 片段。

在构建抗虫棉的基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的 DNA 片段；再利用 DNA 连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组 DNA 分子（图 3-6）。

第三步：将目的基因导入受体细胞

构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。我国科学家采用他们独创的一种方法——花粉管通道法，将 Bt 基因导入了棉花细胞。花粉管通道法有多种操作方式。例如，可以用微量注射器将含目的基因的 DNA 溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将 DNA 溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。除此之外，将目的基因导入植物细胞常用的方法还有农杆菌转化法。

农杆菌转化法：转化（transformation）是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有 Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将 Ti 质粒上的 T-DNA（可转移的 DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体 DNA 上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入 Ti 质粒的 T-DNA 中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。

根据受体植物的不同，所用的具体转化方法有所区别。例如，可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。

第四步：目的基因的检测与鉴定

目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道，这也是检查转基因抗虫棉是否培育成功的一步。

首先是分子水平的检测，包括通过 PCR 等技术检测棉花的染色体 DNA 上是否插入了 Bt 基因或检测 Bt 基因是否转录出了 mRNA；从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测 Bt 基因是否翻译成 Bt 抗虫蛋白等。

其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定 Bt 基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。

在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建基因文库来获取目的基因，并且由于不同转基因产品所需要的目的基因不同，受体细胞又有植物、动物、微生物之分，因此基因表达载体的构建方法不是千篇一律的，将目的基因导入受体细胞的方法也不是完全相同的。例如，将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中（图 3-8），这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。

在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。研究人员一般先用 $\ce{Ca^2+}$ 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。

目前，基因工程已经步入产业化发展阶段，具有巨大的生产力和发展潜力，我们在充满信心和期待的同时，还要严格规范操作流程，科学、客观地评估风险，只有这样，才能让基因工程永葆生机。